__________________________________________
М.М. КУЛИЦА, кандидат вет. наук, ведущий специалист-консультант,
М.И. ДРОНФОРТ, гендиректор ООО «Партнер», Ю.О. СЕЛЯНИНОВ, доктор биолог. наук,
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии
_________________________________________
В статье приведены описание методов и оценка результатов испытания активности дезинфектанта широкого спектра действия с моющим эффектом Абалдез® в отношении вируса АЧС. Доказано, что он эффективно инактивирует вирулентный штамм вируса АЧС на различных поверхностях, имитирующих объекты животноводческих помещений.Ключевые слова: Абалдез®, дезинфекция, тест-культура микроорганизмов, ДТСА, ДТСБ, вирус АЧС, биопроба, подсвинки.
The study of the virucidal activity of disinfectant with washing effect Abaldez® against the virus
of the African plague of pigs
M.M. KULITSA, M.I. DRONFORT, LLC Partner, Yu.O. SELYANINOV, GNU VNIIVViMThe present article gives a description of the methods and evaluation of results testing the activity of disinfectant with
broad spectrum detergent effect Abaldez® against the virus of the African plague of pigs. It is shown that this disinfectant
efficiently inactivates the virulent strain of the virus on various surfaces simulating the object livestock buildings.
Key words: Abaldez®, the disinfection, the test-culture of microorganisms, DTS, TSB, virus, bioassay, gilts.
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
При всем многообразии дезинфицирующих средств, представленных на рынке, количество компонентов, входящих в их состав, весьма ограничено, причем целый ряд соединений обладает высокой бактерио и вирусстатической активностью и низким бактерицидным и вирулицидным действием, что не позволяет им эффективно обеззараживать контамини-рованные поверхности, сильно загрязненные органическими веществами. Особую актуальность проблема внедрения новых высокоэффективных дезинфектантов приобрела в последние годы в связи с продолжающимся распространением на территории РФ африканской чумы свиней, представляющей реальную угрозу свиноводству страны. Специфических средств профилактики АЧС не существует, и, как показал эпизоотический анализ вспышек болезни, ведущую роль в их возникновении играет человеческий фактор. Вирус АЧС перевозится различными видами транспорта из одного региона в другой, очевидно, что в предотвращении дальнейшего распространения болезни одним из важнейших мероприятий является проведение эффективной экспресс-дезинфекции. Учитывая то, что для большинства дезинфектантов их вирулицидная активность в отношении вируса
АЧС не изучена, целесообразно проведение работ по дезинфекции протестированными высокоэффективными дезсредствами.
Материалы и методы
Работы проводились на базе ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Объектом исследования являлось дезинфицирующее средство Абалдез® производства ООО «Партнер». Оно представляет собой бесцветную прозрачную жидкость, содержащую в качестве действующих ве-ществ четвертичные аммониевые соединения, глутаровый альдегид, изопропиловый спирт и вспомогательные компоненты.
Цель исследований
– определить спектр антимикробного действия средства Абалдез® в отношении тест-микроорганизмов
1-й и 2-й группы устойчивости;
– определить дезинфицирую-
щую активность средства Абалдез® в отношении вирулентного штамма вируса АЧС на контаминированных вирусом поверхностях, имитирую-
щих объекты животноводческих помещений.
При работе оценивали следующие показатели:
– инфекционная активность вируса АЧС изолят «Ставрополь» в перевиваемой гибридной линии клеток А4С2 спленоцитов и почки свиньи;
– минимальная бактериостатическая и бактерицидная концентрация средства Абалдез®;
– дезинфицирующее действие средства Абалдез® на вирус АЧС с использованием тест-объектов (шероховатые поверхности из бетона) и постановкой биопробы на подсвин-
ках массой 18–25 кг.
Получение культур тест-микро-организмов
В пробирки со скошенным дрожжевым триптон-соевым агаром (ДТСА) засевали предварительно проверенные на отсутствие посторонней контаминации бактериальной и грибной микрофлорой культуры тест-микроорганизмы (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) в посевной дозе 103–106/мл. Посевы инку-
бировали при температуре +36±1°С в течение 18–20 часов. Суточные культуры контролировали на отсутствие контаминантов. Для этой цели из полученных культур готовили мазки, окрашивали по Граму и подвергали световой микроскопии. Затем агаровые культуры смывали физиологическим раствором.
Определение бактериостатической, бактерицидной активности дезинфекционного средства Абалдез® и влияние на ее уровень высокомолекулярного белка
Предварительную оценку бактерицидного и бактериостатического действия средства Абалдез® проводили методом серийных разведений согласно методическим указаниям в
нашей модификации. Для определения минимальной бактерицидной концентрации средства Абалдез® готовили его серийные двукратные разведения на дрожжевом триптон-соевом бульоне (ДТСБ) от 0,0009% до 0,5% в объеме 2,0 мл.
С использованием денситометра DEN-1 концентрацию микробных клеток в суспензиях тест-микроорганизмов (E.coli штамм К12 и S.aureus штамм 209P) доводили до
0,5 ЕДMF (10^6 м.т./мл). В приготовленные разведенные средства вносили инокулюм одной из культур в объеме 0,2 мл и инкубировали при температуре +37°С.
Результаты учитывали визуально через 18–20 часов инкубации при +37°С по появлению роста культуры в пробирках (бактериостатическое действие). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли по наименьшей концентрации средства, которая подавляла видимый рост тест-микроорганизма.
Контролем служили бульонные культуры микроорганизмов, в которые препарат не вносился. Бактерицидное действие средств изучали по окончании исследований по определению бактериостатического действия. Для этого из пробирок, в которых видимый рост отсутствовал, по 0,2 мл высевали на ДТСА. Посевы инкубировали при +37°С. Учет результатов проводили через 18–24 часа инкубирования и затем через пять суток.
Минимальную бактерицидную дозу определяли по наименьшей концентрации средства, при которой отсутствовал рост микроорганизма на ДТСА. Для изучения влияния высокомолекулярного белка на антимикробную активность проводили аналогичные испытания с добавлением в ДТСБ нормальной сыворотки крови лошади в конечной концентрации 40%.
Определение инфекционной активности вируса АЧС в культуре клеток
Для определения инфекционной активности вируса АЧС готовили десятикратные последовательные разведения вируссодержащей крови на среде Игла МЕМ (с 10-1 до 10-8), которые вносили в четыре пластиковых культуральных флакона объемом 25 см3 с одно-двухсуточной культурой клеток А4С2. Инфицированную культуру А4С2 инкубировали в СО2-инкубаторе при +37±0,5°С в течение шести-семи суток. Наличие вируса в инфицированной культуре клеток определяли по феномену гемадсорбции (адсорбция эритро-
цитов свиней на инфицированных вирусом АЧС клетках). Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и вы-
ражали в lg ГАЕ50/см3.
Оценка дезинфицирующего действия средства Абалдез® in vivo
При исследованиях использовали вирулентный эпизоотически значимый вирус АЧС. На стерильные тест-объекты, имитирующие объекты животноводческих помещений (ше-
роховатые поверхности из бетона), наносили вируссодержащей жидкости по 1,5 мл на 100 см2. В качестве механической защиты вируса использовали стерильный свиной навоз в
количестве 0,3 г сухого вещества на 100 см2 поверхности, что составило 20% органических веществ в вируссодержащей жидкости. Перед нанесением на поверхность вируссодержащую суспензию тщательно перемешивали с соответствующим количеством навоза. Смесь равномерно распределяли на поверхности тестов, после чего
их подсушивали в течение 1–2 часов. Испытуемые 0,7%-ный и 1,0%-ный растворы средства Абалдез® равно-
мерно наносили методом орошения на тест-объекты из расчета 0,3 л/м2.
На контрольные тест-объекты вместо раствора средства Абалдез® наносили такое же количество водопроводной воды, которая использовалась для приготовления раствора средства.
С обработанных 0,7%-ным и 1,0%-ным раствором дезинфектанта тест-объектов через 30 минут отбирали испытуемые материалы. Вирусный материал соскабливали, добавляли по 4,5 мл среды Игла МЕМ, экстрагировали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость сразу ис-
пользовали для постановки биопробы на подсвинках. Биопробу проводили на семи животных: шесть – опытных и один – контроль.
Наблюдение за инфицированными подсвинками производили в течение 21 суток. Специфичность заболевания и гибели животных подтверждали методом обнаружения вируса АЧС в их крови в реакции аутогемадсорбции. Реакцию аутогемадсорбции ставили согласно ГОСТу 28573–90. Дезинфекцию признавали эффективной, если свиньи опытной группы оставались клинически здоровыми на протяжении всего периода наблюдения при гибели животных контрольной группы.
Результаты испытаний
Антимикробную активность средства Абалдез ® изучали в жидких и на твердых питательных средах с возбудителями колибактериоза и стафилококкоза с использованием белковой нагрузки и без нее.
Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли методом серийных разведений в ДТСБ с последующим высевом на ДТСА на чашках Петри.
В таблице 1 представлены результаты изучения бактериостатического и бактерицидного действия средства Абалдез®.
В результате проведенных испытаний установлено, что средство Абалдез® обладает антимикробной активностью в отношении тест-культур грамотрицательных (E.coli) и грамположительных (S.aureus) микроорганизмов в следующих концентрациях, принимая
средство за 100%-ное вещество:
• МПКE.coli – 0,0039%;
• МБКE.coli – 0,0039%;
• МПКS.aureus – 0,0009%;
• МБКS.aureus – 0,0019%.
При добавлении высокомолекулярного белка происходит снижение бактерицидной активности средства в четыре-восемь раз.
При определении инфекционной активности вируса АЧС (изолят «Ставрополь» в виде вируссодержащей крови) установлено, что титр вируса в культуре клеток А4 С2 составляет 7,00 lg ГАЕ50/мл (гемадсорбирующих единиц).
Дезинфицирующее действие 0,7%-ного и 1,0%-ного раствора средства Абалдез® в отношении вируса АЧС, которым были контаминированы впитывающие шероховатые тест-поверхности (бетон), определяли в экспериментах на свиньях, подобранных по принципу аналогов. При этом норма расхода дезсредства при обработке тест-объектов составляла 0,3 л/м2.
Результаты испытаний дезинфицирующего действия средства Абалдез® в отношении вируса АЧС с использованием биопробы представлены в таблице 2.
Из данных таблицы 2 видно, что при орошении средством Абалдез® тест-объектов, контаминированных вирусом АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, поверхности из бетона были обеззаражены 1,0%-ным раствором при экспозиции 30 минут (принимая исходный препарат за
100%) с нормой расхода 0,3 л/м2. Подсвинки этой опытной группы оставались клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения.
Животные опытной группы, зараженные смывом с тест-поверхности, обработанной 0,7%-ным раствором средства с экспозицией 30 минут, и контрольное животное пали на
седьмые-восьмые сутки после заражения с характерной клинической картиной АЧС.
Таблица 1. Антимикробная активность средства Абалдез ® в отношении E.coli и S.aureus (принимая концентрацию исходного образца за 100%)
| Тест-микроорганизм | Вид активности | Антимикробная активность % в отсутствии белка |
Антимикробная активность % в присутствии белка |
|
E.coil K12 |
б/с |
0,0039 |
0,0625 |
| E.coil K12 |
б/ц |
0,0039 |
0,125 |
| S.aureus 209P |
б/с |
0,0009 |
0.0078 |
| S.aureus 209P |
б/ц |
0,0019 |
0.0312 |
Таблица 2. Определение в биопробе дезинфицирующего действия средства Абалдез® при обеззараживании тест-объектов из бетона, контаминированных вирусом АЧС
| № |
Концентрация раствора препарата % |
Норма расхода л/м^2 |
Экспозиция, мин. |
Тест-поверхность бетон пало/всего гол. |
| 1 |
0,7 |
0,3 |
30 |
3/3.0 |
| 2 |
1,0 |
0,3 |
30 |
0/3,0 |
| 3 |
Контроль |
|
1,0/1,0 |
Заключение
По результатам лабораторных исследований, дезинфектант Абалдез® обладает бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении тест-культур грамотрица-
тельных (E.coli) и грамположительных (S.aureus) микроорганизмов, обеспечивая их инактивацию при концентрации 0,0039% и 0,0019% соответственно от исходной без добавления
белковой нагрузки.
При испытаниях на сельскохозяйственных животных (биопроба) установлено, что полное обеззараживание тест-поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений, контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза (20% органи-
ческих веществ в вируссодержащей жидкости), было достигнуто после однократного орошения 1,0%-ным раствором дезинфектанта Абалдез® при экспозиции 30 минут при норме
расхода 0,3 л/м2.
Литература
1. Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффектив-ности и безопасности. Р 4.2.264310. Утверждено главным государственным санитарным врачом РФ 01.06.2010.
2. Методические указания о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики. Утверждено ГУВ Госагро-
прома СССР, 1987.
3. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». МУК 4.2.1890–04. Утверждено главным государственным са-
нитарным врачом РФ 04.03.2004.
4. Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора.
Утверждено департаментом ветеринарии МСХ РФ 15.07.2002.
Дезинфицирующее средство Абалдез® обладает выраженным вирулицидным действием и рекомендуется для применения в очагах заражения АЧС для обработки объектов ветеринарного надзора и транспорта в соответствии с «Правилами проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» (за исключением п. 10),утвержденными департаментом ветеринарии МСХ РФ от 15.07.2002 с целью полной инактивации вируса АЧС и предотвращения его распространения.
